Identyfikacja Francisella tularensis techniką real - time PCR z wykorzystaniem sond hybrydyzujących zaprojektowanych dla fragmentów sekwencji genów fopA i tul4

• Autorzy: Bielawska-Drozd A. , Niemcewicz M. , Gawel J. , Bartoszcze M. , Graniak G. , Joniec J. , Kolodziej M.

Warianty tytułu

EN

Real time PCR hybridization for the rapid and specific identification of Francisella tularensis

• Języki publikacji: PL

Abstrakty

PL

Badano przydatność zaprojektowanych starterów FopA F/R, Tul4 F/R i sond hybrydyzujących FopA S1/S2, Tul4 S1/S2 dla genów fopA i tul4 do wykrywania F. tularensis. W badaniach, w których użyto 50 szczepów F. tularensis uzyskano wyniki dodatnie. Swoistość reakcji wykazano badając szczepy bakterii non-Francisella tularensis. Przy użyciu starterów FopA F/R i sond hybrydyzujących FopA S1/S2 zaprojektowanych dla genów fopA dodatnie wyniki amplifikacji uzyskano ze wszystkimi badanymi szczepami F. tularensis. Identyczne wyniki otrzymano w reakcji real - time PCR z zastosowaniem starterów Tul4 F/R i sond hybrydyzujących Tul4 S1/ S2 zaprojektowanych dla genu tul4. Swoiste produkty reakcji amplifikacji pojawiły się między 16 a 18 cyklem reakcji. Badania z użyciem starterów i sond hybrydyzujących zaprojektowanych dla genu fopA wykazały, że charakterystyczna temperatura topnienia produktów wynosiła 61°C, a dla genu tul4 60°C. Przy użyciu starterów Tul4 F/R i sond hybrydyzujących Tul4 S1/ S2 czułość oznaczeń wynosiła 10 fg/µl, a przy użyciu starterów FopA F/R i sond hybrydyzujących FopA S1/S2 1 fg/µl.

EN

Tularemia is highly infectious and fatal zoonotic disease caused by Gram negative bacteria Francisella tularensis. The necessity to undergo medical treatment in early phase of illness in humans and possibility of making use of bacterial aerosol by terrorists in an attack create an urgent need to implement a rapid and effective method which enables to identify the agent. In our study two primers FopA F/R and hybridization probes Fop A S1/S2 designed from fop A gene sequence, were tested for their potential applicability to identify F. tularensis. In this research 50 strains of F. tularensis were used and the test gave positive results. Reaction specificity was confirmed by using of non - Francisella tularensis bacterial species. The results obtained in the real-time PCR reaction with primers Tul4 F/R and hybridization probes Tul4 S1/S2, designed from tul4 gene, were comparable to the results from previous experiment with fopA - primers set. Investigation of fopA and tul4 primers and hybridization probes properties revealed characteristic Tm (melting temperature) value of the products - 61 °С and 60°C, respectively. Detection sensitivity was remarkably higher when fopA primers set was used 1 fg/µl, and for tul4 primers set, minimal detectable concentration is 10 fg/µl.

Słowa kluczowe

PL

Francisella tularensis; choroby odzwierzece; gen fopA; gen tul4; identyfikacja; metoda real time PCR; sondy hybrydyzacyjne; tularemia; sekwencja genu

• Wydawca: -
• Czasopismo: Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia
• Rocznik: 2010
• Tom: 62
• Numer: 4
• Opis fizyczny: s.351-360,tab.,wykr.,bibliogr.

Twórcy

autor

Bielawska-Drozd A.

• Ośrodek Diagnostyki i Zwalczania Zagrożeń Biologicznych Wojskowego Instytutu Higieny i Epidemiologii w Puławach, Pulawy

autor

Niemcewicz M.

autor

Gawel J.

autor

Bartoszcze M.

autor

Graniak G.

autor

Joniec J.

autor

Kolodziej M.

Bibliografia

• 1. Clemens DL, Lee BY, Horwitz MA. Francisella tularensis enters macrophages via a novel process involving pseudopod loops. Infect and Immun 2005; 73: 5892-902.
• 2. Dennis DT, Inglesby TV, Henderson DA i inni. Tularemia as a biological weapon: medical and public health management. JAMA 2001; 285: 2763-73.
• 3. Ellis J, Oyston PCF, Green M, Titball RW. Tularemia. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 631-46.
• 4. Emanuel PA, Bell R, Dang JL i inni. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. J Clin Microbiol 2003 ; 41: 689-93.
• 5. Forsman M, Sandström G, Sjöstedt A. Analysis of 16S ribosomal DNA sequences of Francisella strains and utilization for determination of the phylogeny of the genus and for identification of strains by PCR. J Syst Bacterid 1994; 44: 38-46.
• 6. Fujita O, Tatsumi M, Tanabayashi K, Yamada A. Development of a Real-time PCR assay for detection and quantification of Francisella tularensis. Jpn J Infect Dis 2006; 59: 46-51.
• 7. Higgins JA, Hubalek Z, Halouzka J i inni. Detection of Francisiella tularensis in infected mammals and vectors using a probe-based polymerase chain reaction. Am J Med Hyg 2000; 62: 310-8.
• 8. Huntley JF, Conley PG, Hagman KE, Norgard MV. Characterization of Francisella tularensis outer mambrane proteins. J Bacteriol 2007; 189: 561-74.
• 9. Mierzyńska D, Hermanowska-Szpakowicz T. Tularemia jako potencjalna broń bioterrorystów. Medycyna Pracy 2002; 53: 279-81.
• 10. Oyston PCF, Sjöstedt A, Titball RW. Tularemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis. Nature Rev Microbiol 2004; 2: 967-78.
• 11. Rastawicki W., Jagielski M. Tularemia. Post. Mikrobiol., 2005, 44: 265-73.
• 12. Saslav S, Eigelsbach HT, Wilson HE i inni. Tularemia vaccine study I. Intracutaneous challenge. Arch Int Med 1961; 107:689-701.
• 13. Sjöstedt A. Family XVII Francisellaceae, genus I Francisella. In: Bergey's manual of systematic bacteriology. Editor. D.J. Brenner, Springer - Verlag, New York 2005.13
• 14. Tarnvik A, Berglund L. Tularemia. Eur Respir J, 2003; 21: 361-73.
• 15. TomasoH, Scholz HC, Neubauer НА і inni. Real-time PCR hybridization for the rapid and specific identification of Francisiella tularensis subspecies tularensis. Mol Cell Probes 2003; 21: 12-67.
• 16. Wicki R., Sauter C., Mettler A., Natsch A. Swiss Army Survey in Switzerland to determine the prevalence of Francisella tularensis, Members of the Ehrlichia phagocytophila genogroup, Borrelia burgdorferi sensu lato, and tick-borne Encephalitis virus in ticks. Eur J Clin Mikrobiol Infect Dis 2000; 19: 427-32.
• 17. Versage JL, Severin DDM, Chu MC, Peterson JM. Development of a multitarget real-time Taq- Man PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens. J Clin Microbiol 2003; 41: 5492-9.