Zastosowanie techniki real-time PCR w diagnostyce patogenów w procesie oczyszczania ścieków

• Autorzy: Kacprzak M. , Fijalkowski K. , Rorat A.

Warianty tytułu

EN

Application of real-time PCR method in the diagnosis of pathogens in sewage treatment process

• Języki publikacji: PL

Abstrakty

PL

Najważniejsze w walce z chorobotwórczymi patogenami jest ich szybkie, skuteczne i dokładne diagnozowanie. Tradycyjne metody, wymagające wielogodzinnych hodowli, są stopniowo wypierane przez narzędzia biologii molekularnej i biochemii, takie techniki jak: PCR, elektroforeza, hybrydyzacja czy znakowanie mikroorganizmów przy pomocy zielonego białka fluorescencyjnego (ang. GFP). Celem badań było określenie, czy metoda real-time PCR może zastąpić tradycyjną metodę posiewów powierzchniowych dla próbek ścieków i osadów ściekowych oraz w jakich okolicznościach jej stosowanie jest wskazane. Określono nie tylko obecność tradycyjnych organizmów wskaźnikowych, takich jak Salmonella typhinmurium czy Clostridium perfringens, ale także oznaczono patogeny „wyłaniające się” (Escherichia coli 0157:H7), oraz tzw. patogeny „nowe” (Yersinia enterocolitica i Legionella pneumophila). Jako fluorochromu użyto DyNAmo HS SYBR Green qPCR Kit. Stwierdzono, że procesy oczyszczania ścieków w znacznym stopniu wpływają na redukcję liczebności wymienionych mikroorganizmów, choć ich nie eliminują, a ścieki i osady ściekowe opuszczające oczyszczalnie mogą nadal pozostawać ich istotnym rezerwuarem. Metoda real-time PCR okazała się wysoce czułą metodą określenia liczebności mikroorganizmów ze ścieków i osadów ściekowych, choć izolacja DNA nie tylko z żywych komórek mikroorganizmów może dać znacznie zawyżone (fałszywie pozytywne) wyniki.

EN

The most important thing when dealing with pathogens is quick, effective and accurate diagnosis. Traditional methods require many hours of culturing and are gradually being replaced by molecular biology and biochemistry tools, involving techniques like PCR, electrophoresis, hybridisation or green fluorescent protein (GFP) marking. The aim of this study was to determine whether real-time PCR may replace the traditional method of surface cultures of environmental samples and when it should be used. The analysed samples came from various stages of wastewater treatment processes. The amount of indicator organisms’ cells like Salmonella typhinmurium or Clostridium perfringens was determined. The method was also tested for “emerging” organisms such as Escherichia coli 0157:H7 and for “new” bacteria like Yersinia enterocolitica or Legionella pneumophila. The DyNAmo HS SYBR Green qPCR Kit was used as a fluoro-chrome. It was noted, that wastewater treatment processes significantly influenced reduction of quantity of studied microorganisms, however do not eliminate them, hence wastewater and sewage sludge may still be an important reservoir of pathogens. The real-time PCR is highly sensitive method, although isolation of DNA not only form alive cells of microorganisms, could resulted in high false positive results.

Słowa kluczowe

EN

waste water treatment; real-time PCR method; real-time polymerase chain reaction; sewage; sewage sludge; pathogen; microorganism number; ethidium monoazide; propidium monoazide

• Wydawca: -
• Czasopismo: Acta Agrophysica
• Rocznik: 2012
• Tom: 19
• Numer: 2
• Opis fizyczny: s.319-327,rys.,tab.,bibliogr.

Twórcy

autor

Kacprzak M.

• Instytut Inżynierii Środowiska, Wydział Inżynierii i Ochrony Środowiska, Politechnika Częstochowska w Częstochowie, ul.Brzeźnicka 60A, 42-200 Częstochowa

autor

Fijalkowski K.

autor

Rorat A.

Bibliografia

• Bień J.B., 2007. Osady Ściekowe. Teoria i praktyka. Wydawnictwo Politechniki Częstochowskiej, Częstochowa.
• Calvó L., Martínez-Planells A., Pardos-Bosch J., Garcia-Gi L.J., 2008. A new real-time PCR assay for the specific detection of salmonella spp. Targeting the bipA Gene. Food Anal. Methods 1, 236-242.
• Francy, D.S., Bushon, R.N., Brady, A.M.G., Bertke, E.E., Kephart, C.M., Likirdopulos, C.A., Mailot, B.E., Schaefer, F.W., III, and Lindquist, H.D.A. 2009, Performance of traditional and molecular methods for detecting biological agents in drinking water: U.S. Geological Survey Scientific Investigations Report, 2009-5097, 17 p.
• Frostegard A., Tunlid A., Baath E., 1993. Phospholipid fatty acid composition, biomass, and activity of microbial communities from two soil types experimentally exposed to different heavy metals. App. Env. Microbiol., 11(59), 3605-3617.
• Gilbride K.A., Lee D.Y., Beaudette L.A., 2006. Molecular techniques in wastewater: Understanding microbial communities, detecting pathogens, and real-time process control. J. Microbiol. Methods, 66(1), 1-20.
• Kacprzak M., Fijałkowski K., 2009. Wstępne badania dotyczące stosowania metody real-time PCRdo wykrywania Salmonella typhimurium w ściekach. Monografie Wydziału Inżynierii Mechanicznej i Robotyki, AGH im. Stanisława Staszica w Krakowie, 38, 105-112.
• Kacprzak M., Stańczyk-Mazanek E., 2003. Changes in the structure of fungal communities of soil treated with sewage sludge. Biol. Fertil. Soils, 38, 89-95.
• Kirk J.L,, Beaudette L.A., Hart M., Moutoglis P., Klironomos J.N., Lee H., 2004. Methods of studying soil microbial diversity. J. Microbiol. Methods, 58, 169-88
• Lambertz S.T., Nilsson C., Hallanvuo S., Lindblad M., 2008. Real-Time PCR method for detection of patho-genic yersinia enterocolitica in food. Appl. Environ. Microbiol., 74(19), 6060-6067.
• Lee D.-Y., Shannon K., Beaudette L.A., 2006. Detection of bacterial pathogens in municipal wastewater using an oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR. J. Microbiol. Methods, 65, 453-467.
• Malik S., Beer M., Megharaj M., Naidu R., 2008. The use of molecular techniques to characterize the micro-bial communities In contaminated soil and water. Environ. Int., 34(2), 265-76.
• Morio F., Corvec S., Caroff N., Le Gallou F., Drugeon H., Reynaud A., 2008. Real-time PCR assay for the detection and quantification of Legionella pneumophila in environmental water samples: Utility for daily practice. Int. J. Hyg. Environ.-Health, 211, 403-411.
• Nocker A., Fernandez P., Burr M.D., Camper A.K., 2007. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol., 73(16), 5111-5117.
• Omiccioli E., Amagliani G., Brandi G., Magnani M., 2009. A new platform for Real-Time PCR detection of Sal-monella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiology, 26, 615-622.
• Schneegurt M.A., Kulpa Ch.F. Jr., 1998. The application of molecular techniques in environmental biotechnology for monitoring microbial systems. Biotechnol. Appl .Biochem., 27, 73-79.
• Shannon K., Lee D.-Y., Trevors J.T., Beaudette L.A., 2007. Detection of bacterial pathogens during wastewater treatment using real-time PCR. Science of the Total Environment, 282, 121-129.
• Soejima T., Iida K., Qin T., Taniai H., Seki M., Yoshida S., 2008. Method to detect only live bacteria during PCR amplification, J. Clin. Microbiol., 46, 2305-2313.
• Varma M., Field R., Stinson M., Rukovets B., Wymer L., Haugland R., 2009, Quantitative real-time PCR analysis of total and propidium. Water Research, 43 (19), 4790-4801
• Volkmann H., Schwartz T., Bischoff P., Kirchen S., Obst U., 2004. Detection of clinically relevant antibiotic-resistance genes in municipal wastewater using real-time PCR (TaqMan). J. Microbiol. Methods, 56, 277-286.
• Wintzingerode F.V., Gobel U.B., Stackebrandt E., 1997. Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based rRNA analysis. FEMS Microbiol. Rev., 21, 213-29.
• Wise M.G., Siragusa G.R., 2005. Quantitative detection of clostridium perfringensin the broiler fowl gastrointestinal tract by real-time PCR. Appl. Environ. Microbiol., 7(71), 3911-3916.

Uwagi

Rekord w opracowaniu