Proteomic analysis of albumin and globulin fractions of pea (Pisum sativum L.) seeds

• Autorzy: Dziuba J. , Szerszunowicz I. , Nalecz D. , Dziuba M.

Warianty tytułu

PL

Proteomiczne badania frakcji albuminowej i globulinowej ziaren grochu siewnego (Pisum sativum L.)

• Języki publikacji: EN

Abstrakty

EN

Background. Proteomic analysis is emerging as a highly useful tool in food research, including studies of food allergies. Two-dimensional gel electrophoresis involving isoelectric focusing and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis is the most effective method of separating hundreds or even thousands of proteins. In this study, albumin and globulin fractions of pea seeds cv. Ramrod were subjected to proteomic analysis. Selected potentially alergenie proteins were identified based on their molecular weights and isoelectric points. Material and methods. Pea seeds (Pisum sativum L.) cv. Ramrod harvested over a period of two years (Plant Breeding Station in Piaski-Szelejewo) were used in the experiment. The isolated albumins, globulins and legumin and vicilin fractions of globulins were separated by two-dimensional gel electrophoresis. Proteomic images were analysed in the ImageMaster 2D Platinum program with the use of algorithms from the Melanie application. The relative content, isoelectric points and molecular weights were computed for all identified proteins. Electrophoregrams were analysed by matching spot positions from three independent replications. Results. The proteomes of albumins, globulins and legumin and vicilin fractions of globulins produced up to several hundred spots (proteins). Spots most characteristic of a given fraction were identified by Computer analysis and spot matching. The albumin proteome accumulated spots of relatively high intensity over a broad range of pi values of -4.2-8.1 in 3 molecular weight (MW) ranges: I - high molecular-weight albumins with MW of -50-110 kDa, II - average molecular-weight albumins with MW of -20-35 kDa, and III - Iow molecular-weight albumins with MW of-13-17 kDa. 2D gel electrophoregrams revealed the presence of81 characteristic spots, including 24 characteristic of legumin and 14-of vicilin. Conclusions. Two-dimensional gel electrophoresis proved to be a useful tool for identifying pea proteins. Pattems of spots with similar isoelectric points and different molecular weights or spots with different isoelectric points and similar molecular weights play an important role in proteome analysis. The regions characteristic of albumin, globulin and legumin and vicilin fractions of globulin with typical MW and pl values were identified as the results of performed 2D electrophoretic separations of pea proteins. 2D gel electrophoresis of albumins and the vicilin fraction of globulins revealed the presence of 4 and 2 spots, respectively, representing potentially allergenic proteins. They probably corresponded to vicilin fragments synthesized during post-translational modification of the analysed protein.

PL

Wprowadzenie. Badania proteomiczne zyskują coraz większe znaczenie zarówno w nauce o żywności, jak i w badaniach nad alergiami. Elektroforeza dwukierunkowa, która obejmuje ogniskowanie izoelektryczne oraz elektroforezę w żelu poliakryloamidowym w obecności siarczanu dodecylu sodu, jest obecnie najbardziej efektywną metodą rozdzielania białek. Liczba tak rozdzielonych białek może sięgać setek, a nawet tysięcy. W pracy przeprowadzono badania proteomiczne frakcji albuminowej i globulinowej ziaren grochu odmiany Ramrod. Istotą badań była identyfikacja określonych białek, głównie mogących wykazywać właściwości alergenne na podstawie ich mas cząsteczkowych i punktów izoelektrycznych. Materiał i metody. Do badań wykorzystano ziarno grochu siewnego, gładkiego (Pisum satirum L.), odmiany Ramrod pochodzące z dwuletnich zbiorów (Stacja Hodowli Roślin, Piaski-Szelejewo).Wyizolowane albuminy, globuliny oraz frakcje globuliny, leguminę i wicylinę, rozdzielano metodą elektroforezy dwukierunkowej. Uzyskane obrazy proteomiczne analizowano komputerowo za pomocą Image MasterTM 2D Platinum. Program wykorzystuje algorytmy programu Melanie. Obliczano względną zawartość, punkty izoelektryczne oraz obserwowane masy cząsteczkowe wszystkich wykrytych białek. Wyniki były obliczane poprzez nakładanie spotów pochodzących z obrazów elektroforegramów, otrzymanych w wyniku trzech niezależnych powtórzeń. Wyniki. Proteomy albumin, globulin i frakcji globulinowych, leguminy i wicyliny, charakteryzowały się obecnością do kilkuset spotów (białek). Na podstawie komputerowej analizy obrazu oraz dopasowania spotów wyznaczono uznane za charakterystyczne dla danej frakcji. Charakterystyczną cechą proteomu albumin grochu było nagromadzenie spotów o stosunkowo dużej intensywności w rozległym zakresie punktów izoelektrycznych pi -4.2-8.1 w trzech zakresach mas cząsteczkowych MW: I obszar to albuminy wysokocząsteczkowe o MW -50-110 kDa, II obszar to albuminy średniocząsteczkowe, których MW mieszczą się w zakresie -20-35 kDa i III obszar to albuminy niskocząsteczkowe o masach cząsteczkowych -13-17 kDa. W obrazie żelu 2D globulin stwierdzono obecność 81 charakterystycznych spotów, z których 24 odpowiadało leguminie, a 14 wicylinie. Wnioski. Metoda elektroforezy dwukierunkowej okazała się narzędziem przydatnym do charakterystyki białek pochodzących z nasion grochu. W ocenie badanych proteomów istotne znaczenie mają uporządkowane serie spotów o zbliżonych punktach izoelektrycznych i różnych masach cząsteczkowych lub zbliżonych masach cząsteczkowych i różnych punktach izoelektrycznych. W wyniku przeprowadzonej analizy elektroforetycznej 2D białek grochu zidentyfikowano obszary występowania charakterystycznych spotów albumin i globulin (w tym leguminy i wicyliny) o określonych wartościach MW i pi, typowych dla tych frakcji. Na podstawie analizy elektroforetycznej 2D albumin i wicylinowej frakcji globulin stwierdzono obecność odpowiednio czterech i dwóch spotów reprezentujących białka, którym są przypisywane właściwości alergenne. Prawdopodobnie odpowiadają one fragmentom wicyliny, które powstają w wyniku posttranslacyjnej hydrolizy tego białka.

• Wydawca: -
• Czasopismo: Acta Scientiarum Polonorum. Technologia Alimentaria
• Rocznik: 2014
• Tom: 13
• Numer: 2
• Opis fizyczny: p.181-190,fig.,ref.

Twórcy

autor

Dziuba J.

• Department of Food Biochemistry, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Plac Cieszynski 1, 10-957 Olsztyn, Poland

autor

Szerszunowicz I.

• Department of Food Biochemistry, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Plac Cieszynski 1, 10-957 Olsztyn, Poland

autor

Nalecz D.

• Department of Food Biochemistry, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Plac Cieszynski 1, 10-957 Olsztyn, Poland

autor

Dziuba M.

• Department of Food Biochemistry, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Plac Cieszynski 1, 10-957 Olsztyn, Poland

Bibliografia

• Akazawa T., Hara-Nishimura I., 1985. Topographic aspects of biosynthesis, extracellular secretion and intracellular storage of proteins in plant cells. Ann. Rev. Plant Phys. 36, 441-472.
• Baringer A., Aubert G., Arnau G., Laine A.L., Deniot G., Potier J., Weinachter C., Lejeune-Henaut I., Lallemand J., Burstin J., 2004, Genetic diversity within Pisum sativum using protein and PCR-based markers. Theor. Appl. Genet. 108, 1309-1321.
• Bradford M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the ąuantitation of microgram ąuantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
• Breiteneder H., Radauer C., 2004. A classification of plant food allergens. J. Allergy Clin. Immun. 113, 821-830.
• Campostrini N., Areces L.B., Rappsilber J., Pietrogrande M.C., Dondi F., Pastorino F., Ponzoni M., Righetti P.G., 2005. Spot overlapping in two-dimensional gel maps: a serious problem ignored for much too long. Proteomics 5, 2385-2395.
• Croy R.R.D., Hoque M.S., Gatehouse J.A., Boulter D., 1984. The major albumin proteins from pea (Pisum sativum L.). Puritications and some properties. Biochem. J. 218, 795-803.
• Dziuba J., Minkiewicz M., Nałęcz D., Dziuba M., Szerszunowicz I., 2009. Reproducibility of two-dimensional electrophoresis gel images of pea (Pisum Sativum L.) seed proteins evaluated using scatter plots - a short report. Pol. J. Food Nutr. Sci. 59 (2), 141-144.
• Freitas R.L., Ferreira R.B., Teixeira A.R., 2000. Use of a single method in the extraction of the seed storage globulins from several legume species. Application to analyse structural comparisons within the major classes of globulins. Int. J. Food Sci. Nutr. 51, 341-352.
• Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A., 2005. Protein identification and analysis tools on the ExPASy Server. In: The proteomics protocols handbook. Ed. J.M. Walker. Humana Press Totowa, USA, 571-607.
• Gatehouse J.A., Croy R.R.D., Morton H., Tyler M., Boulter D., 1981. Characterisation and subunit structure of the vicilin storage proteins of pea (Pisani salirum L.). Eur. J. Biochem. 118, 627-633.
• Görg A., 2004. 2-D electrophoresis. Principles and methods. Handbooks from GE Healthcare. Sweden, 73-75, 133-136.
• Higgins T.J.V., Beach L.R., Spencer D., Chandler P.M., Randall P.J., Blagrove R.J., Kortt A.A., Guthrie R.E., 1987. cDNA and protein sequence of major pea seed albumin (PA 2: Mr -26 000). Plant Mol. Biol. 8, 37-45.
• Hunsucker S.W., Duncan M.W., 2006. Is protein overlap in two-dimensional gels a serious practical problem? Proteomics 6, 1374-1375.
• Kędzior Z., 2004. Białka grochu i ich funkcjonalność w technologii zbóż [Pea proteins and their functionality in grain technology]. Rocz. AR Pozn. Rozpr. Nauk. 348 [in Polish],
• Kjaersgaard I.V.H., Norrelykke M.R., Jessen F., 2006. Changes in muscle proteins during frozen storage revealed by proteome analysis and multivariate data analysis. Proteomics 6,1606-1618.
• Konopka I., Fornal Ł., Dziuba M., Czaplicki S., Nałęcz D., 2007. Composition of proteins in wheat grain streams by sieve classification. J. Sci. Food Agric. 87, 2198-2206.
• Lampart-Szczapa E., 2001. Legume and oilseed proteins. In: Chemical and functional properties of food proteins. Vol. 2. Ed. Z.E. Sikorski. Technomic Publ. Lancaster, Basel, 407-436.
• Lycett G.W., Delauney AJ., Gatehouse J.A., Gilroy J., Croy R.R.D., Boulter D., 1983. The vicilin gene family of pea (Pisum sativum L.): a complete cDNA coding sequence of preprovicilin. Nuci. Acids Res. 11, 2367-2380.
• Mills E.N.C., Jenkins J.A., Alcocer M.J.C., Shewiy P.R., 2004. Structural, biological and evolutionary relationships of plant food allergens sensitizing via the gastrointestinal tract. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 44, 379-407.
• Minkiewicz P., Dziuba J., Darewicz M., Nałęcz D., 2006. Application of high-performance liquid chromatography on-line with ultraviolet/visible spectroscopy in food science. Pol. J. Food Nutr. Sci. 56 ( 1), 145-153.
• Monsalve R.I., Menendez L.A., López-Otin C., Rodriguez R., 1990. β-Tums as structural motifs for the proteolytic Processing of seed proteins. FEBS Lett. 263, 209-212.
• Müntz K., Bassüner R., Lichtenfeld C., Scholz G., Weber E., 1985. Proteolytic cleavage of storage proteins during embryogenesis and germination of seeds. Physiol. Veg. 23, 75-94.
• O’Kane F.E., Happe R.P., Vereijken J.M., Gruppen H., van Boekel M.A.J.S., 2004. Characterization of pea vicilin.1.Denoting convicilin as α-subunit of the Pisum vicilin family. J. Agric. Food Chem. 52, 3141-3148.
• Park S.J., Kim T.W., Baik B.-K., 2010. Relationship between proportion and composition of albumins, and in vitro protein digestibility of raw and cooked pea seeds (Pisum sativum L.). J. Sci. Food Agric. 90, 1719-1725.
• Quillien L., Gaborit T., Guéguen J., 1995. Production an characterization of monoclonal antibodies against 11S storage protein from pea seeds. Phytochemistry 39, 969-976.
• Salgado P., Freire J.B., Ferreira R.B., Seabra M., Teixeira A.R., Toullec R., Lalles J.-P., 2002. Legume proteins of the vicilin family are more immunogenic than those of the legumin family in weaned piglets. Food Agric. Immunol. 14, 51-63.
• Sanchez-Monge R., Lopez-Torrejón G., Pascual C.Y., Varelat J., Martin-Esteban M., Salcedo G., 2004. Vicilin and convicilin are potential major allergens from pea. Clin. Exp. Allergy 34, 1747-1753.
• Sathe S.K., Kshirsagar H.H., Roux K.H., 2005. Advances in seed protein research: A perspective on seed allergens. J. Food Sci. 70, R93-R120.
• Scholz G., Manteuffel R., Müntz K., Rudolph A., 1983. Low molecular - weight polypeptydes of vicilin from Vicia faba L. are product of proteolytic breakdown. Eur. J. Biochem. 132, 103-107.
• Szymkiewicz A., Jędrychowski L., 2006. Determination of pea proteins allergenicity with the use Balb/c mouse. Centr. Eur. J. Immunol. 31, 63-69.
• Tzitizkas E.N., Vincken J.-P., de Groot J., Gruppen H., Visser R.G.F., 2006. Genetic variation in pea seed globulin composition. J. Agric. Food Chem. 54, 425-433.
• Wu C.H., Apweiler R., Bairoch A., Natale D.A., Barker W.C., Boeckmann B., Ferro S., Gasteiger E., Huang H., Lopez R., Magrane M., Martin M.J., Mazumder R., O’Donovan C., Redaschi N., Suzek B., 2006. The Universal Protein Resource (UniProt): an expanding universe of protein information. Nuci. Acids Res. 34, D187-D191.

Uwagi

Rekord w opracowaniu