Cloning of the DNA fragments reflecting the open reading frame I and II of the I-18 C gene of Chironomus tentans. VII. The preparation of the inserts and the translational vector - pET-3a for ligation

• Autorzy: Borowicz B P
• Języki publikacji: EN

Abstrakty

EN

The technology applied for the cloning of the open reading frame (ORF) I and II reflecting DNA fragments in regard to the preparation of the inserts and the translational vector pET-3a for ligation, is described. The main steps of the preparation of the inserts include: digestion of the isolated recombinant bluescript plasmids, carrying the inserts, with the Nde I and Bam HI, purification and isolation of the inserts after the digestion, by the preparative agarose gel electrophoresis (2% gel, 1 x TAE buffer) and then by the centrifugation through the filtration device of the isolated DNA fragment from the gel and also estimation of the inserts concentration by the agarose gel electrophoresis (2% gel, 1 x TBE buffer). The main steps of the preparation of the pET-3a vector included: transformation of the competent E. coli cells of the XL-1 strain with the pET-3a, growing of the transformed bacteria on agar plates (with ampicillin) and then growing of the isolated transformed bacterial colonies in culture to finally isolate the plasmid, digestion of the plasmid with the Nde I and Bam HI, purification of the isolatcd plasmid, after the digestion, by the preparative agarose gel electrophoresis (0.8% gel, 1 x TAE buffer), centrifugation through the filtration device of the isolated DNA fragment from the gel, phenol extraction of the isolated plasmid, estimation of the concentration of the plasmid by the agarose gel electrophoresis (0.8% gel, 1 x TBE buffer).

PL

Opisano technologię zastosowaną do klonowania fragmentów DNA odzwierciedlających otwartą ramę odczytu I i II w zakresie przygotowania wstawek i wektora translacyjnego - pET-3a do ligacji. Główne etapy przygotowania wstawek obejmowały: - trawienie Nde I i Bam HI, wyizolowanych rekombinacyjnych plazmidów blueskrypt, które zawierały wstawki, - oczyszczanie i izolację wstawek, po trawieniu przy użyciu preparatywnej elektroforezy w żelu agarozowym (2% żel, 1 x stężony bufor TAE) i następnie przez odwirowanie wyizolowanego fragmentu DNA z żelu, przy użyciu urządzenia filtracyjnego - oraz ocenę stężenia wstawek przy użyciu elektroforezy (2% żel, 1 x stężony bufor TBE). Główne etapy przygotowania wektora pET-3a obejmowały: transformację komórek kompetentnych E. coli szczepu XL-1, wektorem pET-3a, hodowlę stransformowanych komórek bakteryjnych na płytkach agarowych (z ampicyliną) i następnie hodowlę w kulturze wyizolowanych stransformowanych komórek bakteryjnych w celu izolacji plazmidu, trawienie wyizolowanego plazmidu Nde I i Bam HI oraz jego oczyszczenie po trawieniu, przy użyciu preparatywnej elektroforezy w żelu agarozowym (0.8% żel, 1 x stężony bufor TAE), odwirowanie wyodrębnionego z żelu fragmentu DNA przy zastosowaniu urządzenia filtracyjnego, ekstrakcję fenolową wyizolowanego plazmidu, ocenę stężenia plazmidu przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym (0.8% żel, 1 x stężony TBE).

Słowa kluczowe

EN

pET-3a vector; promoter system; cloning; I-18 C gene; T7 RNA polymerase; Chironomus tentans; polymerase chain reaction; expression; DNA fragment

• Wydawca: -
• Czasopismo: Journal of Plant Protection Research
• Rocznik: 1999
• Tom: 39
• Numer: 1
• Opis fizyczny: p.68-73

Twórcy

autor

Borowicz B P

• Institute of Plant Protection, Miczurina 20, 60-318 Poznan, Poland

Bibliografia

• 1. Borowicz B.P. 1995. Isolation of the DNA fragment reflecting the Open Reading Frame I of the I-18 C gene of Chironomus tentans by the Polymerase Chain Reaction. I. The technology for the preparation of the samples (in English). Prace Nauk. Inst. Ochr. Roślin 36 (1/2): 69-76.
• 2. Borowicz B.P. 1995. Isolation of the DNA fragment reflecting the Open Reading Frame I of the I-18 C gene of Chironomus tentans by the Polymerase Chain Reaction. II. The technology required to obtain the DNA fragment (in English). Prace Nauk. Inst. Ochr. Roślin 36 (1/2): 77-82.
• 3. Borowicz B.P. 1995. Isolation of the DNA fragment reflecting the Open Reading Frame I of the I-18 C gene of Chironomus tentans by the Polymerase Chain Reaction. lll. The effect of the applied technologies (in English). Prace Nauk. Inst. Ochr. Roślin 36 (1/2): 83-93.
• 4. Borowicz B.P. 1996. Isolation of the DNA fragment reflecting the Open Reading Frame II of the I-18 C gene of Chironomus tentans by the Polymerase Chain Reaction. I. The technology for the preparation of the primers. J. Plant Protection Res., 37 (1/2): 138-144.
• 5. Borowicz B.P. 1996. lsolation of the DNA fragment reflecting the Open Reading Frame II of the I-18 C gene of Chironomus tentans by the Polymerase Chain Reaction. II. The technology for the preparation of the template. J. Plant Protection Res., 37 (1/2): 145-148.
• 6. Borowicz B.P. 1996. Isolation of the DNA fragment reflecting the Open Reading Frame II of the I-18 C gene of Chironomus tentans by the Polymerase Chain Reaction. III. The DNA amplification technology. J. Plant Protection Res., 37 (1/2): 149-155.
• 7. Borowicz B.P. 1996. Isolation the DNA fragment reflecting the Open Reading Frame II of the I-18 C gene of Chironomus tentans by the Polymerase Chain Reaction. IV. The product of the applied technologies. J. Plant Protection Res., 37 (1/2): 156-164.
• 8. Borowicz B.P. 1996. Isolation of the DNA fragment reflecting the Open Reading Frame II of the I-18 C gene of Chironomus tentans by the Polymerase Chain Reaction. V. Different mechanisms of regulation regarding the Open Reading Frames. J. Plant Protection Res., 37 (1/2): 165-171.
• 9. Del Sal G.M., Manfioletti G., Schneider C. 1988. A one-tube plasmid DNA mini-preparation suitable for sequencing. Nucl. Acids Res., 16: 9878 pp.
• 10. Heery D.M., Gannon F., Powell R. 1990. A simple method for subcloning DNA fragments from gel slices. Trends in Genet., 6: 173 pp.
• 11. Hindley J. 1983. DNA sequencing. Elsevier Science Publishers.
• 12. Lezzi M., Lutz B., Dorsch-Haesler K. 1989 b. The ecdysterone-controlled chromosome region I-18 C in C. tentans: from cytology to molecular biology. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung., 2: 129-139.
• 13. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Books: 1-3.
• 14. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Plasmid Vectors (chapter 1) in Molecular Cloning. A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Book 1: 1.2-1.110.
• 15. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. DNA Sequencing (chapter 13) in Molecular Cloning. A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Book 2: 13.1-13.104.
• 16. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Expression of Cloned Genes in Escherichia coli (chapter 17) in Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Book 3: 17.2-17.44.
• 17. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T 1989. Commonly Used Techniques in Molecular Cloning (Appendix E) in Molecular Cloning. A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Book 3: E.5-E.7.
• 18. Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubendorff J.W. 1990. Use of T7 RNA Polymerase to direct expression of cloned genes. Methods in Enzymology, Goeddel D.V (ed.), 1985: 60-89.
• 19. Winnacker E.-L. 1987. From Genes to Clones. lntroduction to Gene Technology (in English). VCH Verlags-gesellschaft mbH, D-6940 Weinheim, Germany: 1-634.