Zastosowanie metody real-time PCR do wykrywania RNA enterowirusow czlowieka

• Autorzy: Les K. , Przybylski M. , Dzieciatkowski T. , Mlynarczyk G.

Warianty tytułu

EN

Detection of human enteroviruses with real-time PCR assay using TaqMan fluorescent probe

• Języki publikacji: PL

Abstrakty

PL

Celem pracy było zaprojektowanie i optymalizacja warunków reakcji w metodzie real-time PCR z wykorzystaniem sondy typu TaqMan do wykrywania enterowirusów człowieka. Użyto starterów oraz sondy komplementarnych dla konserwatywnych sekwencji w obrębie regionu niekodującego genomu enterowirusów (5'UTR). Sprawdzono swoistość metody wobec 19 taksonów enterowirusów z grup Coxsackie A, Coxsackie B, echowirusów i enterowirusów 68/71, a także innych wirusów zakażających człowieka. Określono zakres czułości metody względem szeregu dziesiętnych rozcieńczeń zawiesiny wzorcowych szczepów enterowirusów.

EN

Infections with human enteroviruses are common worldwide and cause a wide range of signs and symptoms. Nowadays in current diagnostics procedures older virological methods, such virus isolation in a cell cultures and seroneutralisation assay, are replaced with molecular biology tests. The aim of the study was development of real-time PCR assay for detection of human adenoviruses. DNA isolated from MK2 cell line infected with nineteen different enterovirus strains was used for development of a qualitative real-time PCR assay using primers targeting a conserved region of the 5'UTR region and a specific TaqMan® probe. The analytical sensitivity of real-time PCR assay was tested using serial dilutions of Coxackie A9 cDNA in range between 100 and 10-8. For comparison typical end-point detected RT-PCR for enterovirus detection with the same cDNA dilutions was made. The sensitivity of novel method was about ten thousand-fold higher than older one. The conclusion is that real-time PCR is very advisable in diagnostics of diseases caused with enteroviruses. The high level of sensitivity, specificity, accuracy, and rapidity provided by this assay are favorable for the use in the detection of enteroviral RNA in clinical specimens, especially from neuroinfections.

Słowa kluczowe

PL

czlowiek; metoda real time PCR; enterowirusy; RNA; oznaczanie; sonda typu TaqMan; material kliniczny

• Wydawca: -
• Czasopismo: Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia
• Rocznik: 2010
• Tom: 62
• Numer: 3
• Opis fizyczny: s.245-253,tab.,wykr.,fot.,bibliogr.

Twórcy

autor

Les K.

• Warszawski Uniwersytet Medyczny, ul.Chalubinskiego 5, 02-004 Warszawa

autor

Przybylski M.

autor

Dzieciatkowski T.

autor

Mlynarczyk G.

Bibliografia

• 1. Abzug MJ: The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. Adv Exp Med Biol; 2008; 609: 1-15.
• 2. Binduga-Gajewska I, Gut W, Wielkopolska A, Jarząbek Z: Zastosowanie metody RT-PCR i nested-PCR do wykrywania zakażeń enterowi rusami. Med Dosw Mikrobiol; 1999; 51: 375-81.
• 3. Binduga-Gajewska I, Gut W, Jarząbek Z: Badanie wirusologiczne udziału enterowirusów niepoliomielitycznych w zakażeniach ośrodkowego układu nerwowego w Polsce w latach 1995-2000. Przegl Epidemiol; 2003; 57: 631-7.
• 4. DeBiasi R, Tyler K: Molecular methods for diagnosis of viral encephalitis. Clin Microbiol Rev; 2004; 10: 903-25.
• 5. Gunkey C, Ozkaya E, Yapar M i inni: Laboratory diagnosis of enteroviral infections of the central nervous system by using a nested RT-polymerase chain reaction (PCR) assay. Diagn Microbiol Infect Dis; 2003; 47: 557-62.
• 6. Gunson RN, Collins TC, Carman WF: Practical experience of high throughput real time PCR in the routine diagnostic virology setting. J Clin Virol; 2006; 35: 335-67.
• 7. Hyypiä T, Auvinen P, Maaronen M: Polymerase chain reaction for human picornaviruses, J Gen Virol; 1989; 70: 3261-8.
• 8. Hyypiä T, Hovi T, Knowles NJ i inni: Classification of enteroviruses based on molecular and biological properties. J Gen Virol; 1997; 78: 1-11.
• 9. Mackay IM, Arden KE, Nitsche A: Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res; 2002; 30: 1292-305.
• 10. Muir P, Kammerer U, Korn K i inni: Molecular typing of enteroviruses: current status and future requirements. Clin Microbiol Rev; 1998; 11: 202-27.
• 11. Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR i inni: Molecular evolution of the human enteroviruses: correlation of serotype with VP1 sequence and application to Picornavirus classification. J Virol; 1999; 73: 1941-8.
• 12. Petitjean J, Vabret A, Dina J: Development and evaluation of a real-time RT-PCR assay on the LightCycler for the rapid detection of enterovirus in cerebrospinal fluid specimens. J Clin Virol; 2006; 35: 278-84.
• 13. Rotbart HA, Hayden FG: Picornavirus infections: a primer for the practitioner. Arch Fam Med; 2000;9:913-20.
• 14. Rotbart HA: Enteroviruses. W: Clinical virology. Red. DD Richman, RJ Whitley, FG Hayden, ASM Press, Washington 2002, 971-94.
• 15. Sawyer MH: Enterovirus infections: diagnosis and treatment. Semin Pediatr Infect Dis; 2002; 13: 40-7.
• 16. Yang S, Rothman R: PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acute-care settings. Lancet Infect Dis; 2004; 4: 337-48.