The attempts to produce antiserum against apple stem pitting virus coat protein [ASPV CP] obtained in prokaryotic and eukaryotic expression systems

• Autorzy: Komorowska B , Malinowski T.

Warianty tytułu

PL

Proba uzyskania surowicy na bialko plaszcza wirusa jamkowatosci pnia jabloni [ASPV], przygotowane w prokariotycznym i eukariotycznych systemach ekspresyjnych

• Języki publikacji: EN

Abstrakty

EN

Cloning and expression of the coat protein (CP) gene of Apple stem pitting virus (ASPV; Family: Flexiviride, Genus: Foveavirus) using in vivo Escherichia coli and Pichia pastoris as well as in vitro wheat germ extract gene expression system are described. The coat protein gene was amplified for five ASPV isolates representing three groups characterized by a different size of CPs. The amplified RT-PCR products were cloned into bacteria and yeast expression vectors. Plasmid containing the CP gene of the isolate MT32 was used as a template for expression in wheat germ extract. Proteins of expected sizes, reacting with ASPV antiserum in Western blotting ex­periments, were obtained in three expression systems for the different virus isolates used in this study. The purified proteins were used for immunization and preparation of rabbit polyclonal antisera. The obtained antibodies could be used for immunocap- ture RT-PCR detection of ASPV in woody tissue, but ELISA results were not satis­factory.

PL

W pracy opisano klonowanie i ekspresję genu białka pJaszcza wirusa jamkowato- ści pnia jabłoni (ASPV; Rodzina: Flexiviride Rodzaj: Foveavirus) z użyciem dwóch systemów ekspresyjnych in vivo: bakteryjnego (Escherichia coli) i drożdżowego (Pichia pastoris) oraz systemu in vitro z wykorzystaniem ekstraktu z kiełków pszeni­cy. Gen białka płaszcza zamplifikowano dla pięciu izolatów ASPV reprezentujących trzy grupy charakteryzuj ące się różną wielko ści ą bia łka płaszcza. Produkty rT-PCR wklonowano do bakteryjnego i drożdżowego wektora ekspresyjnego. Plazmid zawie­rający gen białła płaszcza izolatu MT32 był wykorzystany jako matryca do ekspresji w ekstrakcie z kiełków pszenicy. Białka o oczekiwanej wielkości, reaguj ące w metodzie Western blotting z suro­wic ą uczuloną na ASPV, uzyskano w trzech systemach ekspresyjnych dla różnych izolatów wirusa. Oczyszczone białko było użyte do immunizacji i przygotowania surowic. Uzyskane przeciwciał umożliwiał wykrywanie ASPV w jabłoni i gruszy metodą IC-RT-PCR. Wyniki testów ELISA nie byty zadowalające.

Słowa kluczowe

EN

apple stem pitting virus coat protein; coat protein; Flexiviride; Foveavirus; prokaryotic expression system; eukaryotic expression system; gene expression; antibody

• Wydawca: -
• Czasopismo: Journal of Fruit and Ornamental Plant Research
• Rocznik: 2009
• Tom: 17
• Numer: 2
• Opis fizyczny: p.21-30,fig.,ref.

Twórcy

autor

Komorowska B

• Research Institute of Pomology and Floriculture, Pomologiczna 18, 96-100 Skierniewice, Poland

autor

Malinowski T.

Bibliografia

• Barbara D.J., Clark M.F. 1982. A simple indirect ELISA using F(ab')2 fragments of immunoglobulin. J. GEN. VIROL. 58: 315-322.
• Clark M. 1981. Immunosorbent assays in plant pathology. ANNU. REV. PHYTOPATHOL. 19: 83-106.
• Candresse T., Lanneau M., Revers F., Grasseau M., Macquaire G., German S., Malinowski T., Dunez J. 1995. An immunocapture PCR assay adapted to the detection and the analysis of the molecular variability of the apple chlorotic leaf spot virus. ACTAHORT. 386:136-147.
• Hema M., Kirthi N., Sreenivasulu P., Savithri H.S. 2003. Development of recombinant coat protein antibody based IC-RT-PCR for detection and discrimination of sugarcane streak mosaic virus isolates from South In­dia. ARCH. VIROL. 148: 1185-1193.
• Jelkmann W., Kunze L., Vetten H.J., Lesemann D.E. 1992. cDNA cloning of dsRNA associated with apple stem pitting disease and evidence for the relationship of the virus-like agents associated with apple stem pitting and pear vein yellows. ACTA HORT. 309: 55-62.
• Jelkmann W., Keim-Konrad R. 1997. Immuno-capture polymerase chain reac­tion and platetrapped ELISA for the de­tection of Apple stem pitting virus. J. PHYTOPATHOL. 145: 499-503.
• Koganezawa H., Yanase H. 1990. A new type of elongated virus isolated from apple trees containing the stem pitting agent. PLANT DIS. 74: 610-614.
• Komorowska B., Malinowski T., Zawadzka B. 1999. Amplification of the coat protein gene of Apple stem pitting virus (ASPV). PHYTOPATH. POL. 17: 49-59.
• Komorowska B. 2002. Badania nad zróżni­cowaniem molekularnym izolatów wirusa jamkowatości pnia jabłoni poprzez sekwencjonowanie genu bi­ałka płaszcza. Ph. D. Thesis, Institute of Pomology and Floriculture, Skier­niewice, Poland.
• Malinowski T., Golis T., Zawadzka B. 1996. Wstępne wyniki badań nad wykrywaniem wirusa jamkowatości pnia jabłoni (ASPV) i wirusa żółta­czki nerwów gruszy (PVYV) metodą F(ab')2-ELISA i RT-PCR. Preliminary results of the studies on detec­tion of ASPV and PVYV using F(ab')2 ELISA and RT-PCR. Ogólnopol. Konf. Ochr. Rośl. Sadow., 20­21 lutego 1996, Skierniewice, pp. 173-175.
• Malinowski T. 2005. Potential problems with the reliability of PCR based diag­nostic methods related to plant vi­ruses sequence variation. PHYTO- PATH. POL. 35: 125-139.
• Nemchinov L., Hadidi A., Faggioli F. 1998. PCR-detection of Apple stem pitting virus from pome fruit hosts and sequence variability among viral isolates. ACTAHORT. 472 (1): 67-73.
• Olmsted J.B. 1981. Affinity purification of antibodies from diazotised paper bots of heterogeneous protein samples. J. BIOL. CHEM. 256: 11955-11957.
• Petrovic N. 2003. First detection of Rupestris stem pitting associated vi­rus particles by antibody to a recom­binant coat protein. PLANT DIS. 87 (5): 510-514.
• Rybicki E.P. 1986. Affinity purification of specific antibodies from plant vi­rus capsid protein immobilised on ni­trocellulose. J. PHYTOPATHOL. 116: 30-38.
• Schwarz K., Jelkmann W. 1998. Detec­tion and characterization of apple stem pitting virus sources from apple and pear by PCR and partial se­quence analysis. ACTA HORT. 472 (1): 75-85.
• Vaira A.M., Vecchiati M., Masenga V., Accotto P. 1996. A polyclonal antise­rum against a recombinant viral pro­tein combines specificity with versa­tility. J. VIROL. METHODS. 56: 209-219.
• Wetzel T., Candresse T., Macquaire G., Ravelonandro M., Dunez J. 1992. A highly sensitive immunocapture poly- merase chain reaction method for plum pox potyvirus detection. J. VIROL. METHODS. 39: 27-37.