Wykrywanie enterotoksynogennych szczepów Staphylococcus spp., wyizolowanych od krów z mastitis, metodą multipleks PCR

• Autorzy: Nawrotek P. , Swiderska M. , Fijalkowski K. , Kogut K. , Czernomysy-Furowicz D.

Warianty tytułu

EN

Detection of enterotoxigenic Staphylococcus spp. strains, isolated from cows with mastitis, using multiplex-PCR

• Języki publikacji: PL

Abstrakty

PL

Celem podjętych badań była identyfikacja oraz analiza molekularna 35 szczepów Staphylococcus spp., wyizolowanych z mleka krów z kliniczną postacią mastitis, pod kątem ich potencjalnej zdolności do wytwarzania enterotoksyn gronkowcowych (SEs), najczęściej wywołujących zatrucia pokarmowe ludzi (SEA-SEE).Wytypowane szczepy scharakteryzowano wstępnie na podstawie wzrostu kolonii bakteryjnych na chromogennym podłożu CHROMagar Staph. aureus. Następnie wszystkie izolaty analizowano z użyciem gatunkowo specyficznej reakcji PCR, ukierunkowanej na wykrycie dwóch markerów molekularnych: nuc – specyficznego dla gatunku S. aureus i gehM – specyficznego dla S. xylosus. Dodatkowo oznaczano enterotoksynogenność wykrytych szczepów (obecność genów sea-see, w tym secv), z użyciem metody multipleks PCR. Spośród 35 analizowanych izolatów aż 18 szczepów (51,4%) stanowiło gronkowce koagulazoujemne (CNS) z gatunku S. xylosus, a tylko dwa izolaty (5,7%) należały do koagulazododatnich szczepów S. Aureus. W przypadku siedmiu szczepów S. xylosus (20%) wykryto metodą multipleks PCR geny enterotoksyn (se) zidentyfikowane jako: sea (71,4%), secv (14,3%) oraz sed (14,3%). Ponadto, w DNA pięciu spośród tych szczepów (71,4%), uzyskano amplikony specyficzne dla innych, bliżej nieokreślonych genów se lub ich wariantów, które na podstawie analizy in silico oznaczono jako: seg, seh, sei lub selu. Uzyskane wyniki wskazują na konieczność uwzględniania w diagnostyce gronkowców koagulazoujemnych ich właściwości toksynogennych, ponieważ mogą one stanowić ważną grupę mikroorganizmów obecnych w żywności. Przyczyniły się także do podkreślenia znaczącej roli enterotoksynogennych szczepów S. xylosus w etiologii mastitis.Wykonane badania potwierdziły przydatność metod molekularnych do wykrywania potencjalnie enterotoksycznych szczepów Staphylococcus spp. izolowanych od zwierząt.

EN

The aim of the study was the identification and molecular analysis of 35 Staphylococcus spp. strains, isolated from milk of cows with clinical form of mastitis, regarding to its potential ability to produce enterotoxins (SEA-SEE). All examined strains were first characterized on the basis of the image analysis of the bacterial colony growth on chromogenic medium CHROMagar Staph. aureus. In the next step all strains were analyzed using the species-specific PCR, based on detection of two molecular markers: nuc – specific for S. aureus and gehM – specific for S. xylosus. Additionally, enterotoxigenicity of identified strains (presence of seasee genes, including secv), in the multiplex-PCR was performed.Atotal of 35 isolates from milk samples of bovine clinical mastitis cases were analyzed and 18 strains (51.4%) classified as S. xylosus (CNS), where only two strains (5.7%) were coagulase-positive S. aureus. Seven isolates of S. xylosus (20%) were positive for enterotoxin genes (se), as detected by multiplex-polymerase chain reaction, with sea (71.4%), secv (14.3%) and sed (14.3%). In addition, in the case of five strains (71.4%), amplicons specific for others, indefinable se genes or their variants were detected, which on the basis of in silico analysis were identified as: seg, seh, sei or selu. The data showed that the toxigenic properties of CNS should not be ignored and further investigation of this group of microorganisms in food could be very important.Moreover the research contributed to emphasize the meaning of enterotoxigenic S. xylosus strains in the etiology of cows’ mastitis. The study also confirmed the usefulness of molecular methods in detection of potentially enterotoxic Staphylococcus spp. strains, isolated from animals.

Słowa kluczowe

PL

bydlo polskie holsztynsko-fryzyjskie; krowy; zapalenie gruczolu mlekowego; postac kliniczna; mleko krowie; Staphylococcus; szczepy koagulazoujemne; enterotoksyny; metoda multiplex PCR

• Wydawca: -
• Czasopismo: Acta Scientiarum Polonorum. Zootechnica
• Rocznik: 2010
• Tom: 09
• Numer: 4
• Opis fizyczny: s.161-172,rys.,tab.,bibliogr.

Twórcy

autor

Nawrotek P.

• Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, ul. Doktora Judyma 24, 71-466 Szczecin

autor

Swiderska M.

autor

Fijalkowski K.

autor

Kogut K.

autor

Czernomysy-Furowicz D.

Bibliografia

• Asao T., Kumeda Y., Kawai T., Shibata T., Oda H., Haruki K., Nakazawa H., Kozaki S., 2003.An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: estimation of enterotoxinAin the incriminatedmilk and powdered skimmilk. Epidemiol. Infect. 130 (12), 33–40.
• Becker K., Keller B., Eiff C., Brück M., Lubritz G., Etienne J., Peters G., 2001. Enterotoxigenic potential of Staphylococcus intermedius. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5551–5557.
• Bhatia A., Zahoor S., 2007. Staphylococcus aureus enterotoxins: a reviev. J. Clin. Diagn. Res. 1 (2), 188–197.
• Brody T., Yavatkar A.S., Lin Y., Ross J., Kuzin A., Kundu M., Fann Y., Odenwald W.F., 2008. Horizontal gene transfers link a human MRSA pathogen to contagious bovine mastitis bacteria.PLoS ONE 3 (8), 1–8.
• Bystroń J., Bania J., Żarczyńska A., Korzekwa K., Molenda J., Kosek-Paszkowska K., 2006. Detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus strains using a commercial Elisa and Multiplex-PCR. Bull. Vet. Inst. Pulawy 50, 329–333.
• Cunha M.L.R.S., Calsolari R.A.O., 2007. Toxigenicity in Staphylococcus with emphasis on coagulase- negative staphylococci. Communicating current research and educational topics and trendsin Applied Microbiology 2, 778–782.
• Fueyo J.M.,Mendoza M.C., Rodicio M.R.,Muniz J.,Alvarez M.A.,Martίn M.C., 2005. Cytoxin and pyrogenic toxin superantigen gene profiles of Staphylococcus aureus associated with subclinicalmastitis in dairy cows and relationships with macrorestriction genomic profiles. J. Clin. Microbiol. 43 (3), 1278–1284.
• Gaillot O., Wetsch M., Fortineau N., Berche P., 2000. Evaluation of CHROMagar Staph. aureus, a new chromogenic medium, for isolation and presumptive identification of Staphylococcus aureusfrom human clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 38 (4), 1587–1591.
• Garcia M.L.,Moreno B., Bergdoll M.S., 1980. Characterization of staphylococci isolated from mastitic cows in Spain. Appl. Environ. Microbiol. 39 (3), 548–553.
• HillW.E., 1996. The polymerase chain reaction: applications for the detection of foodborne pathogens. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 36 (1–2), 123–173.
• Iacumin L., Comi G., Cantoni C., Cocolin L., 2006. Molecular and technological characterization of Staphylococcus xylosus isolated from naturally fermented Italian sausages by RAPD, Rep--PCR and Sau-PCR analysis. Meat Sci. 74, 281–288.
• Klotz M., Opper S., Heeg K., Zimmermann S., 2003. Detection of Staphylococcus aureus enterotoxins A to D by Real-Time fluorescence PCR assay. J. Clin. Microbiol. 41 (10), 4683–4687.
• Kochman M., Ławrynowicz-Paciorek M., Piekarska K., Magdziak A., Kałużewski S., 2005. Charakterystyka szczepów Staphylococcus aureus izolowanych z próbek żywności. Med. Dośw.Mikrobiol. 57, 241–246.
• Koziel J., Maciąg-Gudowska A., Potempa J., 2008. Staphylococcus aureus jako wewnątrzkomórkowy patogen komórek układu immunologicznego. Postępy Mikrobiol. 47 (3), 393–399.
• Kuźma K.,Malinowski E., Lassa H., Kłossowska A., 2005.Wytwarzanie enterotoksyn oraz toksyny zespołu wstrząsu toksycznego przez szczepy Staphylococcus aureus izolowane z mastitis u krów.Med.Weter. 61 (3), 282–284.
• Lamprell H., Villard L., Chamba J.-F., Beuvier E., Borges E., Maurin F., Mazerolles G., Noel Y., Kodjo A., 2004. Identification and biotyping of coagulase positive staphylococci (CPS) in ripenedFrench raw milk cheeses and their in vitro ability to produce enterotoxins. Revue Méd.Vét. 155 (2), 92–96.
• Letertre C., Perelle S., Dilasser F., Fach P., 2003. A strategy based on 5’ nuclease multiplex PCR to detect entrotoxin genes sea to sej of Staphylococcus aureus.Mol. Cell. Probes. 17 (5), 227–235.
• Loir Y.L., Baron F.,Gautier M., 2003. Staphylococcus aureus and food poisoning.Genet.Mol. Res. 2 (1), 63–76.
• Ławrynowicz-Paciorek M., Kocham M., Piekarska K.,Wyrębiak A., Potracka E., Leniak-Chmiel U., Magdziak A., 2006. Występowanie enterotoksyn u szczepów Staphylococcus aureus izolowanychod chorych hospitalizowanych i nosicieli. Med. Dośw. Mikrobiol. 58 (4), 275–281.
• Malinowski E., Gajewski Z., 2009. Charakterystyka zapaleń gruczołu mlekowego u krów wywoływanych przez odżywnościowe patogeny człowieka. ŻycieWeter. 84 (4), 290–294.
• Nawrotek P., Borkowski J., Boroń-Kaczmarska A., Furowicz A.J., 2005. Charakterystyka enterotoksyn gronkowcowych wytwarzanych przez szczepy izolowane od krów z zapaleniem gruczołumlekowego (mastitis), z uwzględnieniem elementów epidemiologicznych. Prz. Epidemiol. 59,891–902.
• Nedelkov D., Nelson R.W., 2003. Dtetection of staphylococcal enterotoxin B via Biomolecular interaction analysis mass spectrometry. Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5212–5215.
• Omoe K., Hu D.-L., Takahashi-Omoe H., Nakane A., Shinagawa K., 2003. Identification and characterization of a new staphylococcal enterotoxin-related putative toxin encoded by two kinds of plasmids. Infect. Immun. 71 (10), 6088–6094.
• Ono H.K., Omoe K., Imanishi K., Iwakabe Y., Hu D.-L., Kato H., Saito N., NakaneA., Uchiyama T., Shinagawa K., 2008. Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins, types S and T. Infect. Immun. 76 (11), 4999–5005.
• Orwin P.M., Leung D.Y.M., Donahue H.L., Novick R.P., Schlievert P.M., 2001. Biochemical and biological properties of staphylococcal enterotoxin K. Infect. Immun. 69 (1), 360–366.
• Rall V.L.M., Sforcin J.M., Augustini V.C.M.,Watanabe M.T., Fernandes Jr.A., Rall R., Silva M.G., Araújo Jr. J.P., 2010. Detection of enterotoxin genes of Staphylococcus sp isolated from nasalcavities and hands of food handlers. Braz. J. Microbiol. 41 (1), 59–65.
• Seo K.S., Park J.Y., Terman D.S., Bohach G.A., 2010.Aquantitative real time PCRmethod to analyze T cell receptorVβ subgroup expansion by staphylococcal superantigens. J. Transl.Med. 7 (8), 1–31.
• Sharma N.K., Rees C.E.D., Dodd C.E.R., 2000. Development of a single-reactionmultiplex PCR toxin typing assay for Staphylococcus aureus strains.Appl. Environ. Microbiol. 66 (4), 1347–1353.
• SibbaldM.J.J.B., ZiebandtA.K., Engelmann S., HeckerM., JongA., Harmsen H.J.M., Raangs G.C., Stokroos I., Arends J.P., Dubois J.Y.F., Dijl J.M., 2006. Mapping the pathways to staphylococcalpathogenesis by comparative secretomics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70 (3), 755–788.
• Thomas D.Y., Jarraud S., Lemercier B., Cozon G., Echasserieau K., Etienne J., Gougeon M.-L., Lina G., Vandenesch F., 2006. Staphylococcal enterotoxin-like toxins U2 and V, two new staphylococcalsuperantigens arising from recombination within the enterotoxin gene cluster. Infect.Immun. 74 (8), 4724–4734.
• Tietze M., Hunc D., Bryl M., 2004. Zdrowotność gruczołu mlekowego i stan sanitarny surowego mleka zbiorczego w gospodarstwach specjalistycznych Podkarpacia. Zesz. Nauk. Akad. Rol.Wroc. Zootechnika LI (501), 325–330.
• Udo E.E., Al-Bustan M.A., Jacob L.E., Chugh T.D., 1999. Enterotoxin production by coagulasenegative staphylococci in restaurant workers from Kuwait City may be a potential cause of foodpoisoning. J. Med. Microbiol. 48, 819–823.
• Wang S.-C.,Wu C.-M., Xia S.-C., QI Y.-H., Xia L.-N., Shen J.-Z., 2009. Distribution of superantigenic toxin genes in Staphylococcus aureus isolates from milk samples of bovine subclinicalmastitis cases in two major diary production regions of China. Vet. Microbiol. 137 (3–4),276–281.
• Wilson I.G., Cooper J.E., Gilmour A., 1991. Detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in dried skimmed milk: use of the polymerase chain reaction for amplification and detection of staphylococcal genes entB and entC1 and the thermonuclease gene nuc. Appl. Environ. Microbiol.57 (6), 1793–1798.

Uwagi

Rekord w opracowaniu