Effect of peucedanin and bergapten (5-MOP), furanocoumarins isolated from Peucedanum tauricum Bieb. (Apiaceae) fruits, on apoptosis induction and heat-shock protein expression in HeLa cells

• Autorzy: Bartnik M , Glowniak K. , Jakubowicz-Gil J. , Pawlikowska-Pawlega B. , Gawron A.

Warianty tytułu

PL

Wpływ peucedaniny i bergaptenu, furanokumaryn izolowanych z owoców Peucedanum tauricum Bieb .(Apiaceae), na indukcję apoptozy i ekspresję białek szoku termicznego w komórkach HeLa

• Języki publikacji: EN

Abstrakty

EN

In the research effects of bergapten (5-MOP) and peucedanin, furanocoumarins isolated from fruits of Peucedanum tauricum Bieb. (Apiaceae), on apoptosis, necrosis and heat-shock proteins Hsp 27 and Hsp 72 expression in human carcinoma cells HeLa B (ECACC No 85060701) were preliminary studied. The purity of analysed compounds was confirmed by RP HPLC, EI-MS and 1D, 2D NMR. For apoptosis and necrosis detection the mixture of Hoechst 33342 and propidium iodide (PI) was used. Early apoptosis was detected using Annexin V Test. Cells were incubated with furanocoumarins at the concentrations of 1, 5, 10 and 15 μg/ml. The level of heat-shock protein expression was determined by Western blot technique. Quantitative analysis of Hsp 27 and Hsp 72 was done with the Bio-Profil Bio-1D Windows Application V.99.03 program. The obtained results were analysed for significance by one-way ANOVA test. As a result of our experiments we found that peucedanin was more effective in apoptosis induction than bergapten. In HeLa cells treated with peucedanin only low necrosis was observed. The incubation with 15 μg/ml of peucedanin for 24 hours inhibited Hsp 72 expression in cells by 77.5% (± 0.05), and Hsp 27 by 74.0% (± 0.02) after five hours of treatment as compared to the control. The inhibition of Hsps expression after peucedanin treatment may be responsible for increased apoptosis induction (11 .4%) detected by Annexine V test. Incubation with furanocoumarins has an influence on morphology of HeLa cells (many cytoplasmic protrudings and bulges of “blebbing” cytoplasm were observed).

PL

Podjęto próbę określenia wpływu peucedaniny i bergaptenu, związków furanokumarynowych wyizolowanych z owoców gorysza krymskiego (Peucedanum tauricum Bieb.) na indukcję apoptozy i nekrozy oraz ekspresję białek szoku termicznego Hsp 27 i Hsp 72 w komórkach HeLa B(ECACC No 85060701). Czystość analizowanych związków naturalnych potwierdzono metodami chromatograficznymi i spektralnymi RP HPLC, MS, 1D i 2D NMR. Identyfikacji apoptozy i nekrozy w badanych komórkach HeLa dokonano przy użyciu mieszaniny barwiącej fluorochromów: Hoechst 33342 i jodku propidionowego (PI). Do określenia wczesnej apoptozy wykorzystano test z aneksyną V. W badaniach stosowano różne stężenia związków kumarynowych (1, 5, 10 i 15 μg/ml) oraz różny czas inkubacji. Aby zbadać wpływ związków kumarynowych na ekspresję białek szoku termicznego, wykonano elektroforezę białek na żelu poliakryloamidowym SDS/PAGE i technikę immunoblotingu. Do ilościowej analizy ekspresji białek szoku termicznego Hsp 27 i Hsp 72 wykorzystano program Bio-Profil Bio-1D Windows Application V.99.03. Do analizy statystycznej uzyskanych wyników badań biologicznych użyto testu ANOVA. Rezultaty badań pozwalają stwierdzić, że z obu analizowanych substancji peucedanina w większym stopniu indukuje apoptozę. Jednocześnie zaobserwowano tylko nieznaczną nekrozę komórek poddanych działaniu peucedaniny. Po inkubacji z peucedaniną (przy stężeniu 15 μg/ml) stwierdzono obniżenie ekspresji białek szoku termicznego Hsp 72 po 24-godzinnej inkubacji do 77,5% (±0,05), a Hsp 27 po pięciogodzinnej inkubacji do 74,0% (±0,02) w porównaniu z materiałem kontrolnym. Obniżenie ekspresji białek szoku może mieć związek ze wzmożonym efektem proapoptotycznym peucedaniny (w teście wczesnej apoptozy wzrost do 11,45%; w materiale kontrolnym — 0,5%). Ponadto w obrazie morfologicznym komórek poddanych działaniu związków kumarynowych zaobserwowano zmiany w porównaniu z materiałem kontrolnym (wydłużanie się komórek, pojawianie się wypustek cytoplazmatycznych i uwypukleń).

Słowa kluczowe

EN

furanocoumarin; Apiaceae; HeLa cell; isolation; heat shock protein; peucedanin; Peucedanum tauricum; apoptosis; Bergapten preparation; protein expression; fruit

• Wydawca: -
• Czasopismo: Herba Polonica
• Rocznik: 2006
• Tom: 52
• Numer: 4
• Opis fizyczny: p.71-78,fig.,ref.

Twórcy

autor

Bartnik M

• Skubiszewski Medical University, 1 Chodzki Street, 20-093 Lublin, Poland

autor

Glowniak K.

autor

Jakubowicz-Gil J.

autor

Pawlikowska-Pawlega B.

autor

Gawron A.

Bibliografia

• 1. Murray RDH, Mendez J, Brown SA. The Natural Coumarins. Villey, Chirchester 1982.
• 2. Murray RDH. Natural Occurring Plant Coumarins. Springer–Verlag, Vienna, New York 1991.
• 3. Ojala T, Vuorela P, Kiviranta J, Vuorela H, Hiltunen R. A bioassay using Artemia salina for detecting phototoxicity of plant coumarins. Planta Med 1999; 65:715–8.
• 4. Colombain M, Goll V, Muyard F, Girard C, Bevalot F, Richert L. A bioassay using the human hepatoblastoma cell line HepG2 detecting phototoxicity of furocoumarins. Planta Med 2001; 67(7):644–6.
• 5. Laurantha J. Photochemotherapy. Clinics Dermatol 1997; 15:769–80.
• 6. Vermel EM, Kruglyak-Syrkina SA. The effect of phosphoramid and of peucedanine on transplantable animal tumors. Voprosy Onkol 1959; 5 (7):43–51.
• 7. Lee YM, Wu TH, Chen SF, Chung JG. Effect of 5-methoxypsoralen (5-MOP) on cell apoptosis and cell cycle in human hepatocellular carcinoma cell line. Toxicol in Vitro 2003; 17:279–87.
• 8. Samali A, Cotter TG. Heat-shock proteins increase resistance to apoptosis. Exp Cell Res 1996; 223:163–70.
• 9. Felström B, Zezina L. Apoptosis: Friend or Foe. Transpl Proceed. 2001; 33:2414–16.
• 10. Głowniak K, Bartnik M, Mroczek T, Zabża A, Wierzejska A. Application of column chromatography and preparative TLC for isolation and purification of coumarins from Peucedanum tauricum Bieb. fruits. J Planar Chromatogr 2002; 15:94–100.
• 11. Bartnik M. Doctoral dissertation. Lublin Medical University, Lublin 2004.
• 12. Jankowska A, Skonieczna D, Rommerts FFC, Warchoł JB. Investigation on apoptosis in Leidig cells cultured in vitro. Folia Histochem Cytobiol 1997; 36:99–110.
• 13. Bradford MM. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72:248–54.
• 14. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227:680–5.
• 15. Jakubowicz-Gil J, Rzymowska J, Gawron A. Quercetin, apoptosis, heat shock. Biochem Pharmacol 2002; 64:1591–5.