The use of reverse transcription and polymerase chain reaction [RT-PCR] for the detection of hop latent viroid [HLVd]

• Autorzy: Cajza M , Wypijewski K. , Pospieszny H.

Warianty tytułu

PL

Wykrywanie wiroida latentnego chmielu [HLVd] przy pomocy odwrotnej transkrypcji reakcji lancuchowej polimerazy [RT-PCR]

• Języki publikacji: EN

Abstrakty

EN

The simple method of nucleic acids extraction, based on guanidine thiocyanate extraction buffer, was sufficient for obtaining a good templates for RT-PCR. The RT-PCR reactions were performer from the start to the end (both the reverse transcription and the HLVd-cDNA amplification) in the same reaction mixture and in the very small volume of reaction (10 μI). Both pairs of primers designed by authors were good for reverse transcription and later for amplification of the HLVd-cDNA. The presence of gelatin as a stabilizer of DNA polymerase was indispensable for successful performance of RT-PCR.

PL

Wiroidy, najmniejsze obecnie znane patogeny roślin, zbudowane z pojedynczej nici kolistego RNA, nie zawierające w swej budowie i nie kodujące żadnych białek, są groźnymi patogenami roślin wyższych, rozpowszechnionymi we wszystkich rejonach świata, szczególnie w uprawach roślin rozmnażanych wegetatywnie. Wiroid latentny chmielu (ang. hop latent viroid - HLVd) został wykryty dopiero w 1988 roku w chmielu. Do tej pory odnotowano go w rejonach uprawy chmielu na całym świecie. Chmiel, jedyny znany żywiciel tego patogena, ulega tylko infekcjom utajonym (latentnym). HLVd powoduje zarówno spadek masy plonu szyszek jak i zawartości alfa-kwasów w szyszkach. Bezobjawowe infekcje oraz brak białek strukturalnych i innych produktów translacji powodują, że obecnie patogena tego można wykrywać tylko przy pomocy elektroforezy (metoda bardzo zawodna, wymagająca wysokiego stężenia RNA patogena w tkance), sond hybrydyzacyjnych i rozwijanej w ostatnich latach metody RT-PCR. Podczas opracowywania RT-PCR do wykrywania HLVd w ekstraktach kwasów nukleinowych wykorzystywano dwie pary primerów specyficznych dla sekwencji nukleotydowej HLVd, charakteryzujących się różnymi temperaturami topnienia produktu. Wiroida wykrywano w ekstraktach kwasów nukleinowych z blaszek liściowych i z ogonków liściowych chmielu. Uproszczona metoda guanidynowa do izolacji totalnych kwasów nukleinowych okazała się wystarczająca do przeprowadzenia reakcji RT-PCR. Opracowana metoda charakteryzowała się bardzo dużą czułością, specyficznością (produkty amplifikacji cDNA-HLVd uzyskiwano tylko z próbek materiału roślinnego pochodzącego z roślin zawierających tego wiroida) i szybkością wykonania (dwa dni łącznie z ekstrakcją kwasów nukleinowych). Ponadto w zastosowanej metodzie opracowano warunki do przeprowadzenia zarówno odwrotnej transkrypcji i następnie amplifikacji powstałego cDNA wiroida w jednej probówce, w tej samej mieszaninie reakcyjnej . Oprócz tego wszystkie reakcje RT-PCR prowadzono w bardzo małej objętości równej 10 μl (2 μl zawiesiny kwasów nukleinowych i 8 μl mieszaniny reakcji RT-PCR). Maksymalne uproszczenie metody, wielokrotne obniżenie kosztów reakcji oraz charakterystyczna dla RT-PCR czułość, specyficzność i szybkość przeprowadzenia testu sprawiają, że może być ona wykorzystywana do rutynowego wykrywania nie tylko HLVd ale również innych wiroidów, wirusoidów i wirusów RNA.

Słowa kluczowe

PL

patogeny roslin; lancuchowa reakcja polimerazy; wiroid latentny chmielu; wiroidy; odwrotna transkrypcja; wykrywanie

• Wydawca: -
• Czasopismo: Journal of Plant Protection Research
• Rocznik: 1997
• Tom: 37
• Numer: 1-2
• Opis fizyczny: s.52-58,fot.,bibliogr.

Twórcy

autor

Cajza M

• Instytut Ochrony Roslin, ul.Miczurina 20, 60-318 Poznan

autor

Wypijewski K.

autor

Pospieszny H.

Bibliografia

• 1. Barbara D.J., Morton A., Adams A.N. 1990a. Assessment of UK hops for the occurrence of hop latent and hop stunt viroids. AnnaIs of Applied Biology. 116: 265-272.
• 2. Barbara D.J., Morton A., Adams A. N., Green C. P. 1990b. Some effect of hop latent viroid on two cultivars of hop (Humulus lupulus) in the UK. Annals of Applied Biology. 117: 359-366.
• 3. Chomczyński P., Sacchi N. 1987. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem., 162: 156-159.
• 4. Dasso C., Jackson R.J. 1989. Efficient initiation of mammalian translation at a CUG codon. Nucleic Acids Research, 17: 6485-6497.
• 5. Finckh U., RoIfs A. 1995. PCR optimization strategies. In, Boehringer Mannheim - PCR applications manual : 36-41.
• 6. Hadidi A., Levy L., PodIeckis E. V. 1995. Polymerase chain reaction technology in plant pathology. In Molecular Methods in Plant Pathology, Ed. by R. P. Singh and U. S. Singh., Lewis Pub., 13 : 167-187.
• 7. Hadidi A., Yang X. 1990. Detection of pome fruit viroids by enzymatic cDNA amplification. Journal of Virological Methods. 30: 261-270.
• 8. Hataya T., Hikage K., Suda N., Nagata T., Li S., Itoga Y., Tanikoshi T., Shikata E. 1992. Detection of hop latent viroid (HLVd) using reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR). Ann. of the Phytopathological Society of Japan, 58. 5: 677-684.
• 9. Kozak M. 1989. Context effects and inefficient initiation at non-AUG codons in eukaryotic cell-free translation systems. Molecular Cell Biology, 9: 5073-5080.
• 10. Lee J.Y., Lee S.H., Sänger H.L. 1990. Viroid diseases occurring on Korean hop plants. Korean Journal of Plant Pathology, 6: 256-260.
• 11. Morton A., Barbara D.J., Adams A. N. 1993 . The distribution of hop latent viroid within plants of Humulus lupulus and attempts to obtain viroid free plants. Annals of Applied Biology, 123: 47-53.
• 12. Puchta H., Ramm K., Sanger H.L. 1988a. Nucleotide sequence of hop stunt viroid isolate from German grapevine cultivar ‘Riesling’. Nucleic Acids Research, 16, 6: 2730 pp.
• 13. Puchta H., Ramm K., Sänger H.L. 1988b. The molecular structure of hop latent viroid (HLV), a new viroid occurring worldwide in hops. Nucleic Acids Research, 16: 4197-4216.
• 14. Puchta H., Ramm K., Sänger H.L. 1988c. Hop latent viroid (HLVd) and the worldwide distribution of latent viroids in vegetatively propagated plants. Proceedings Int. Workshop on Hop Virus Diseases Rauischholzhausen 1988, - A.Eppler Edt., Deutsche Phytomedizinische Gesellschaft: 181-190.
• 15. Rezaian M. A., Koltunow A.M., Krake L.R. 1988. Isolation of three viroids and a circular RNA from grapevines. Journal of General Virology. 69, 2: 413-422.
• 16. RychIik W., Rhoads R.E. 1989. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and for in vitro amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 17: 8543 pp.
• 17. RychIik W., Spencer W.J., Rhoads R.E. 1990. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Research. 18: 6409-6412.
• 18. Sänger H.L., Lee J.Y. 1993. Molecular biology of the viroids, the smallest pathogens recently known. Korean Journal of Plant Pathology, 9,2: 139-148.
• 19. Sano T., Hataya T., Terai Y., Shikata E. 1989. Hop stunt viroid strains from dapple fruit disease of plum and peach in Japan. Journal of General Virology. 70,6: 1311-1319.
• 20. Sasaki M., Shikata E. 1977. On some properties of hop stunt disease agent, a viroid. Proc. Japan Acad. 53B: 109-112.
• 21 . Shikata E. 1990. New viroids from Japan. Seminars in Virology, 1: 107-115 .
• 22 . Symons R. H. 1991. The intriguing viroids and virusoids: what is their information content and how did they evolve? Molecular Plant-Microbe lnteractions, 4,2: 111-121.