Rozpoznawanie izolowanych od ludzi nicieni z rodzaju Dirofilaria przy zastosowaniu technik biologii molekularnej

• Autorzy: Masny A. , Zarnowska-Prymek H. , Cielecka D. , Salamatin R. , Golab E.

Warianty tytułu

EN

Procedures for species identification of the nematodes belonging to Dirofilaria genus present in the clinical material isolated from humans

• Języki publikacji: PL

Abstrakty

PL

Przedstawiono opis procedur zaadaptowanych do izolacji i wykrywania DNA pasożytów z rodzaju Dirofilaria w materiale izolowanym od ludzi i przechowywanym w: etanolu (24 tygodnie), formalinie (46 tygodni) lub zatopionym w bloczkach parafinowych (25 tygodni). Najwyższą czułość PCR obserwowano dla próbek DNA uzyskanych z robaków przechowywanych w etanolu, a najniższą dla próbek pochodzących z materiału przechowywanego w formalinie. Izolacja DNA z pasożyta utrwalonego w formalinie była trudniejsza niż w wypadku pozostałych preparatów, a produkty jego powielania były wykrywalne tylko w Real Time PCR. Uzyskane wyniki pokazują, że metody molekularne są stosunkowo łatwym w użyciu sposobem identyfikacji nicieni z rodzaju Dirofilaria obecnych w materiale klinicznym utrwalonym na różne sposoby. Wskazane jest niestosowanie formaliny do przechowywania materiału, który ma być użyty do diagnostyki opartej o PCR.

EN

Procedures for DNA extraction and amplification were modified to allow identification of Dirofilaria nematodes surgically removed from human tissues. Worm samples stored in: ethanol (24 weeks), formalin (46 weeks) or paraffin blocks (25weeks) were examined. Fragments of two ribosomal DNA regions (5.8S-ITS2-28S, 5SrRNA) and mitochondrial cytochrome oxidase subunit I gene were used as diagnostic markers. The highest PCR sensitivity was observed for DNA obtained from the worm preserved in ethanol, while the nucleic acid extracted form the parasite stored in formalin yielded the lowest PCR sensitivity. DNA extraction from the parasite preserved in formalin was more time consuming than DNA extraction from the remaining samples. Furthermore, the amplification of DNA isolated from the formaldehyde preserved worm allowed for identification of the parasite species only when the mitochondrial marker was used in Real Time PCR, and the amount of the obtained product was close to the detection limit. Species identification of the worms stored in the paraffin block and in ethanol was possible with both traditional and Real Time PCR. All analyzed worms were identified as D. repens which confirmed the species identification based on morphological features. The results show that molecular methods are relatively simple to use and suitable for identification of Dirofilaria sp. nematodes present in clinical material. Formalin is not suitable for storing material intended for molecular tests.

Słowa kluczowe

PL

pasozyty czlowieka; nicienie; DNA; oznaczanie; Dirofilaria; lancuchowa reakcja polimerazy; biologia molekularna

• Wydawca: -
• Czasopismo: Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia
• Rocznik: 2010
• Tom: 62
• Numer: 2
• Opis fizyczny: s.181-188,tab.,fot.,wykr.,bibliogr.

Twórcy

autor

Masny A.

• Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Panstwowy Zaklad Higieny, ul.Chocimska 24, 00-791 Warszawa

autor

Zarnowska-Prymek H.

autor

Cielecka D.

autor

Salamatin R.

autor

Golab E.

Bibliografia

• 1. Babal P, Kobzova D, Novak I, Dubinsky P i inni. First case of cutaneous human dirofilariosis in Slovak Republic. Bratisl Lek Listy 2008; 109: 486-8
• 2. Boom R, Sol C, Beid M i inni. Improved silica-guanidinium thiocyanate DNA isolation procedure based on selective binding of bovine alpha-casein to silica particles. J Clin Microbiol 1999; 37: 615-9
• 3. Boom R, Sol CJ, Salimans MM i inni. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol 1990; 28: 495-503
• 4. Cancrini G, Scaramozzino P, Gabrielli S i inni Aedes albopictus and Culexpipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. J Med Entomol 2007; 44:1064-6
• 5. Cordonnier C, Chatelain D, Nevez G i inni. Difficulties in diagnosis of human dirofilariasis outside known enzootic areas. Rev Med Interne 2002; 23: 71-6
• 6. Demiaszkiewicz AW, Polańczyk G, Pyziel AM i inni. Pierwsze ogniska dirofilariozy psów wywołanej przez Dirofilaria repens Raili iet et Henry, 1911 w centralnej Polsce. Wiad Parazytol 2009; 55: 367-70
• 7. Do H, Dobrovic A. Limited copy number-high resolution melting (LCN-HRM) enables the detection and identification by sequencing of low level mutations in cancer biopsies. Mol Cancer 2009; 8:82
• 8. Korolev VA, Romashova MF. Dirofilariasis in the Autonomous Republic of Crimea Med Parazitol (Mosk). 2005; 1:50-1
• 9. Kuzmin Y, Varodi E, Vasylyk i inni. Experimental infection of mosquitoes with Dirofilaria repens (Nematoda, Filarioidea) larvae. Vestn Zool 2005;39:19-24
• 10. Miething F, Hering S, Hanschke В і inni. Effect of fixation to the degradation of nuclear and mitochondrial DNA in different tissues. J Histochem Cytochem 2006; 54: 371-4
• 11. Miterpáková M, Antolová D, Hurníková Z i inni. Dirofilaria infections in working dogs in Slovakia. J Helminthol 2010; 84: 173-6
• 12. Overgaauw PA, van Dijk E P. A worm infection in the skin of a dog. First autochthonous Dirofilaria repens infection of a dog in the Netherlands. Tijdschr Diergeneeskd 2009; 134: 936-8
• 13. Pampiglione S, Rivasi F. Human dirofilariasis due to Dirofilaria (Nochtiella) repens: an update of world literature from 1995 to 2000. Parassitologia 2000; 42: 231-54
• 14. Rishniw M, Barr SC, Simpson KW i inni. Discrimination between six species of canine microfilariae by a single polymerase chain reaction. Vet Parasitai 2006 135: 303-14
• 15. Żarnowska-Prymek H, Cielecka D, Salamatin R. Dirofilarioza - Dirofilaria repens, po raz pierwszy opisana u polskich pacjentów. Przegl Epidemiol 2008; 62: 547-51