Usefulness of new DNA extraction procedure for PCR technique in species identification of Entamoeba isolates

• Autorzy: Myjak P , Kur J. , Pietkiewicz H.

Warianty tytułu

PL

Przydatnosc nowej metody izolacji DNA do identyfikacji izolatow Entamoeba technika PCR

• Języki publikacji: EN

Abstrakty

EN

In this study we have developed a modified CLARK and DIAMOND (1992, 1993) method using the polymerase chain reaction to amplify amoebic ribosomal RNA genes that allow either specific detection of Entamoeba histolytica s. str. or amoeba species identification. DNA was isolated from cultured protozoa or from stool samples (cysts andlor trophozoites). Cultures of xenie or axenic material (also stool samples) were treated with Easy Genomic DNA Prep or Genomic DNA Prep Plus (A&A Biotechnology, Poland) for DNA isolation. With these new procedures, DNA can be obtained effectively and with high degree of purity. 13 amoeba strains were investigated. Three strains produced an 876 bp fragment with Psp5 and Psp3 primers (specific product for E. histolytica s. str). Three strains gave a specific 876 bp product for E. dispar with NPsp5 and NPsp3 primers. Two strains were E. moshkovskii as identified by KpnI digestion of PCR products obtained with RD5 and RD3 primers. Four strains (one of them was cultured in two laboratories) were E. invadens as identified by HinfI or HhaI digestion of PCR products obtained with RD5 and RD3 primers. Characteristic RFLP patterns with these enzymes was also obtained for E. terrapinae and Blastocystis hominis. This RFLP analysis show significant promise as a medical diagnostic tool particularly useful for species identification.

PL

W przedstawionej pracy rozwinięto i zmodyfikowano metodę CLARKA i DIAMONDA (1992, 1993) amplifikacji techniką PCR pełzakowych genów kodujących rybosomalne RNA, pozwalających na swoiste wykrywanie Entamoeba histolytica sensu stricto lub identyfikację gatunkową pełzaków. DNA izolowano z pierwotniaków hodowanych in vitro lub z prób kału (cysty i/lub trofozoity). Izolację DNA z aksenicznych lub poliksenicznych kultur (także próbek kału) przeprowadzano przy użyciu Easy Genohistolytica DNA Prep lub Genomic DNA Prep Plus (A&A Biotechnology, Polska). Stosując te nowe procedury uzyskiwano DNA wydajnie i o dużym stopniu czystości. Przebadano 13 szczepów pełzaków. Trzy szczepy dawały produkty PCR o wielkości 876 pz ze starterami Psp5 i Psp3 (swoisty produkt dla E. histolytica s. str). Trzy szczepy dawały swoisty dla E. dispar produkt o wielkości 876 pz ze starterami NPsp5 i NPsp3. Dwa szczepy należały do E. moshkovskii, co wykazała indentyfikacja przez trawienie KpnI produktów PCR otrzymanych ze starterami RD5 i RD3. Cztery szczepy Geden z nich hodowany w dwóch laboratoriach) zidentyfikowano jako E. invadens przez trawienie HinfI i HhaI produktów PCR otrzymanych ze starterami RD5 i RD3. Charakterystyczny wzór RFLP z tymi enzymami otrzymano także z E. terrapinae i Blastocystis hominis. Ta analiza RFLP wskazuje na jej przydatność w diagnostyce medycznej, a szczególnie w identyfikacji gatunków.

Słowa kluczowe

PL

metody badan; parazytologia; lancuchowa reakcja polimerazy; izolaty; ameby; pasozyty; izolacja; Entamaeba; identyfikacja; DNA

• Wydawca: -
• Czasopismo: Wiadomości Parazytologiczne
• Rocznik: 1997
• Tom: 43
• Numer: 2
• Opis fizyczny: s.163-170, tab.,tabl.,bibliogr.

Twórcy

autor

Myjak P

• Departament Parazytologii Tropikalnej, ul.Powstania Styczniowego 9b, 81-519 Gdynia

autor

Kur J.

autor

Pietkiewicz H.

Bibliografia

• ACUNA-SOTO R., SAMUELSON J., DE GIROLAMI P., ZARATE L., MILLAN-VELASCO F., SCHOOLNICK G., WIRTH D. 1993. Application of the polymerase chain reaction to the epidemiology of pathogenic and nonpathogenic Entamoeha histolytica. Am. J. Trop. Med. Hyg. 48: 8-70.
• CLARK C. G., DIAMOND L. S. 1991a. Ribosomal RNA genes of „pathogenic" and „nonpathogenic" Entamoeha histolytica are distinct. Mol. Biochem. Parasitol. 49: 297-302.
• - - 1991b. The Laredo strain and other Entamoeha histolytica-like amoebae are Entamoeha moshkovskii. Ibid. 49: 11-18.
• - - 1992. Differentiation of pathogenic Entamoeba histolytica from other intestinal protozoa by riboprinting. Arch. Med. Res. 23: 15-16.
• - - 1993. PCR detection of pathogenic Entamoeba histolytica and differentiation from other intestinal protozoa by riboprinting. In: D. H. Pershing, T. F. Smith, F. C. Tenover, T. J. White [Eds], Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and applications. Amer. Soc. Microbiol., Washington, D.C.: 468-474.
• DIAMOND L. S. 1968. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J. Parasitol. 54: 1047-1056.
• - CLARK C. G. 1993. A redescription of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 (Emended Walker, 1911) Separating it from Entamoeba dispar Brumpt, 1925. J. Euk. Microbiol. 40: 340-344.
• - HARLOW D. R., CUNNICK C. C. 1978. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 72: 431-432.
• JACKSON T. F. H. G. 1995. Epidemiology of Entamoeba histolytica. European Conference on Tropical Medicine, Hamburg, Germany, 22-26 October 1995: L63.
• KUR J., BURKIEWICZ A., ZABŁOCKA A., GOSPODAREK E. 1995. Identification of Pseudomonas aeruginosa on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. Acta Microbiol. Polon. 44: 111-117.
• MITTAL V., BHATTACHARYA A., BHATTACHARYA S. 1994. Isolation and characterization of a species-specific multicopy DNA sequence from Entamoeba histolytica. Parasitology 108: 237-244.
• MYJAK P. 1967. The effect of temperature on the survival rate of Entamoeba histolytica (Schaudinn, 1903) cysts in water. Biul. Inst. Med. Mor. 18: 35-42.
• - KUR J. 1995. Modilication of PCR method for detection of Entamoeba species. European Conference on Tropical Medicine, Hamburg, Germany, 22-26 October 1995: L120.
• NOWAK A., BURKIEWICZ A., KUR J. 1995. PCR differentiation of seventeen genospecies of Acinetobacter. FEMS Microbiol. Lett. 126: 181-188.
• - KUR J. 1995. Genohistolytica species typing of acinetobacters by polymerase chain reaction amplification of the recA gene. Ibid. 130: 327-332.
• PAVLOVA E. A. 1938. Sur les methodes de la culture d'Entamoeba histolytica. Med. Paraz. (in Russian) 7: 244-247.
• SACHADYN P., KUR J. 1995. Detection of Helicobacter pylori in human gastric biopsy and fecal samples by PCR. Basic and clinical aspects of Helicobacter pylori infection. J. Physol. Pharmacol. 46: 66.
• TACHIBANA H., KOBAYASHI S., TAKEKOSHI M., IHARA S. 1991. Distinguishing pathogenic isolates of Entamoeba histolytica by Polymerase Chain Reaction. J. Infect. Dis. 164: 825-826.
• TANNICH E., BURCHARD G. D. 1991. Differentiation of pathogenic from nonpathogenic Entamoeba histolytica by restriction fragment analysis of a single gene amplified in vitro. J. Clin. Microbiol. 29: 250-255.